Juliane Köhler ist die Tochter eines Puppentheaterschauspielers. Anfangs besuchte sie zwei Jahre lang das Schauspielstudio Gmelin in München. Von 1985 bis 1988 machte sie in New York eine Schauspielausbildung bei Uta Hagen und besuchte das H. B. Schauspielstudio. Des Weiteren nahm sie Ballettunterricht bei Daniela Glück in München. 1988 erhielt sie ein Engagement am Niedersächsischen Staatstheater Hannover und ist seitdem regelmäßig auf deutschen Theaterbühnen zu sehen. Im Jahr 1993 wechselte sie an das Bayerische Staatsschauspiel in München. Bis 1997 gehörte sie dem Ensemble an. Wegen verschobener Dreharbeiten zu Aimée und Jaguar konnte sie einen Termin für die Proben zu Das Käthchen von Heilbronn am Residenztheater nicht einhalten und wurde entlassen. Später erhielt sie ein Engagement an denMünchner Kammerspielen. Seit Herbst 2001 arbeitet Juliane Köhler erneut am Bayerischen Staatsschauspiel. Anfang der 1990er Jahre begann sie auch mit ersten Rollen im Film Fuß zu fassen. Zwei Produktionen des Jahres 1999 sorgten für ihren endgültigen Durchbruch beim breiten Publikum: Aimée und Jaguar sowie Pünktchen und Anton. 2001 spielte sie die Hauptrolle in Caroline Links Oscar-prämiertem Kinodrama Nirgendwo in Afrika. Oliver Hirschbiegelgab ihr 2004 die Rolle der Eva Braun in seinem Oscar-nominierten Film Der Untergang. Im mehrfach ausgezeichneten Kurzfilm Haber (2008) verkörperte sie die Ehefrau des Chemikers Fritz Haber, Clara Immerwahr. Im Jahr 2010 spielte sie in der sechsteiligen ZDF-Fernsehserie Klimawechsel die Rolle der Cornelia Koch.
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